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基于分子生物学的玉兰蓟马的鉴定

作者: 何思瑶,田立超等 时间:2018-2-11 阅读次数:1199

蓟马为昆虫纲缨翅目昆虫的统称,常刺吸植物汁液为害,造成寄主植物叶片、花朵等失色、萎蔫。笔者在进行西南大学病虫害调查时,在玉兰花部发现一种蓟马为害,造成花瓣皱缩并产生黄褐色斑点(图1-2),这是蓟马为害玉兰的首次发现。因蓟马体形小,传统形态学鉴定较为困难,所以为确定该蓟马种类,笔者采用分子生物学手段对其进行鉴定,并委托专家进行形态学鉴定,根据二者鉴定的结果,确定该蓟马种类为黄蓟马Thrips flavus Schrank, 1776。

一/材料和方法

1.1 蓟马的采集

将带有蓟马的玉兰花瓣浸泡于无水乙醇中,待蓟马浮起后收集置于离心管中。

1.2 分子生物学鉴定

1.2.1 总DNA提取

蓟马总DNA提取参照基因组DNA小量制备试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司生产)使用说明的DNA提取方法。取蓟马5-10头,置于研钵中加入液氮用力、快速研磨至粉状,加入350µl PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,2 mmol/L KH2PO4,Ph 7.2~7.4)和0.9 µl RNaseA,温和研磨30s;将混合液转移至2ml离心管,加入150µl Buffer C-L和20µl 蛋白酶K,旋涡震荡1min。短暂离心后,置于56℃水浴10min;加入350µl Buffer P-D,旋涡震荡30s,12000×g离心10min;将混合液转移至2ml离心管中的DNA制备管中,12000×g离心1min,弃废液;加入500µl Buffer W1,12000×g离心1min,弃废液;加入700µl Buffer W2,12000×g离心1min,弃废液,确保盐分被完全清除,消除对酶切的影响;再将制备管12000×g离心1min;将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中,在制备管中加入100-200µl 水浴至65℃ 的Eluent 或去离子水,室温静置1min,12000×g离心1min,洗脱DNA;将提取的总DNA放入-20℃保存。

1.2.2 PCR扩增

以DNA为模板,利用通用引物LCO1490/HCO2198(表1)(英骏捷基(上海)贸易有限公司合成)进行PCR扩增。反应体系为25µl,其中双蒸水15.25µl、Mg2+ 2.0µl、DNTP 2.0µl、Buffer Mix 2.5µl、DNA模板1µl、Taq酶0.25µl、引物2µl(正反各1µl)。PCR反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环,最后一个循环72℃延伸10min。PCR扩增反应在Eppendorf PCR仪上进行。

1.2.3 PCR产物检测及测定

取2-3µl PCR产物进行测定,以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,电泳缓冲液为1×TAE,以DL2000(Takara)作为分子量大小的标记,用GoodViewII染色,于紫外光下检测,判断产物是否含有目的片段,若为清晰单一条带,不含非特异性扩增条带;若电泳条带太暗或无条带,则重新进行PCR。PCR产物交送英骏捷基(上海)贸易有限公司进行正反链双向测序。

1.2.4 序列对比和分析

将获得的两端序列反向拼接,用DNAman进行蛋白质翻译,确定密码子位点,将测定得到的DNA条形码序列在BARCODE OF LIFE DATA SYSTEM中进行Blast比对,确定与之相匹配的种类。

1.3 形态学鉴定

形态学鉴定主要参考《中国经济昆虫志 第五十五册 缨翅目》,根据缨翅目分科、属、种的检索表对其进行初步鉴定,后委托西北农林大学冯纪年教授团队和云南农业大学张宏瑞教授团队进行确认。

二/结果与分析

2.1 分子鉴定

测序后得到该蓟马的COI基因序列,将该序列在BARCODE OF LIFE DATA SYSTEM中进行比对,结果显示序列与黄蓟马相匹配,相似度为99.84%-100%(图3),从分子生物学上确定该蓟马为黄蓟马。

2.2 形态鉴定(图3-5)

根据形态观察,该蓟马体主要黄色;触角7节;单眼间鬃间距小,在前单眼之后,位于前、后单眼內缘连线上;前翅前脉鬃3根;腹部背侧片无成排纤维毛及无附属鬃;腹部腹片无附属鬃;腹部节III和节IV背片的II鬃(亚中对鬃)短于和细于鬃III;腹部节II-VI背片中对鬃和亚中对鬃甚小于III-VI鬃,符合黄蓟马的鉴定特征,因此初步鉴定该蓟马为黄蓟马,与经西北农林大学冯纪年教授团队和云南农业大学张宏瑞教授团队的鉴定结果一致,因此在形态学上将该蓟马鉴定为黄蓟马。

综合分子生物学及形态学鉴定的结果,确定该蓟马种类为黄蓟马,这是黄蓟马在玉兰上危害的首次报道。

三/讨论

目前对蓟马的鉴定主要依靠外部形态,但在实际操作中存在较大局限:1)蓟马近缘种之间的区别特征少且不明显,传统方法容易造成错误鉴别;2)传统方法难以鉴定蓟马幼虫或残缺个体[14]。而基于PCR技术的分子鉴定为物种的鉴定提供了新的手段,弥补了传统形态鉴定的诸多不足,可以检测物种间及同种个体间的细微差别[15]。本研究以CO I为标记基因,利用分子生物学的方法对危害玉兰的蓟马进行了鉴定,鉴定结果与外部形态相同,这也与游中华[14-15]、闫丹侃[16]等的研究结果一致,说明了利用CO I基因对黄蓟马进行鉴定的可行性。这是黄蓟马在玉兰上为害的首次报道,其在玉兰及其他新寄主植物上的为害机制有待于进一步研究。

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