川山茶与杜鹃红山茶杂交胚拯救创制四季川山茶新材料研究

四川山茶又称为川山茶（Camellia japonica），作为我国五大山茶花品系之一，因其主要分布在四川地区而得名。该地区常年湿润多雨，相对空气湿度大，全日照天数少，使得川山茶树姿挺拔秀丽，叶片终年长青，严冬顶霜怒放，在中国茶花中独具一格，具有很高的观赏价值和生态价值。川山茶的栽培历史距今至少已有1800年[1]，作为川渝地区市街应用的首选材料，其栽培品种约150个，花期主要从11月至翌年4月，但缺乏夏季和秋季开花的品种。

1／四季茶花育种现状

四季茶花又称为多季开花的茶花，一般茶花的花期是11月至翌年4月[3]。四季茶花的花期为夏季、秋季和冬季，特别是在炎炎夏季不断开放鲜艳的花朵。四季茶花新品种的培育主要得益于杜鹃红山茶（C. azalea）、崇左金花茶（C. chuangtsoensis）和毛籽金花茶（C. pilosperma）等夏季开花原种的发现，并作为杂交亲本应用[4-6]。自夏季开花原种发现以来，四季茶花新品种育种便成为国际山茶花育种热点，育种方法主要为传统杂交育种、实生苗选育、芽变选种等方式。其中，杜鹃红山茶原产于广东，盛花期6月至11月，花朵为单瓣红色，是我国独有的能够四季开花的稀有山茶原种，也是四季茶花育种的首选亲本[5]。

目前，国内外四季茶花育种均采用传统杂交方法。以杜鹃红山茶为亲本的四季茶花育种中，以广东棕榈园林股份有限公司高继银研究团队的研究成果卓著，现已获得四季茶花杂交新品种317个，实现多季或四季开花。编写出版两部《四季茶花杂交新品种彩色图集》，引领世界四季茶花育种[7-9]。其中25个品种获得国家林业和草原局新品种保护授权，30个品种在国际茶花协会登陆。

上海市园林科学规划研究院和上海星源农业实验场培育出 ‘星源晚秋’、‘星源红霞’、‘星源花歌’3个品种，于2019年通过国家林业和草原局新品种保护办公室的新品种审定[10,11]。继广东棕榈园林股份有限公司、美国长木植物园之后[12]，美籍华人王大庄通过传统杂交育种方式，在世界上第三个成功实现杜鹃红山茶杂交育种，并于2015年登录香花型杜鹃红山茶新品种‘夏粉含香’[13]。

2／胚拯救和体细胞胚胎发生途径在山茶新种质培育方面的应用

胚拯救是育种研究中克服胚败育或者发育不良，提高胚萌发率以及提早萌发，缩短植物发育时间的有效手段。体细胞胚胎发生途径是指体细胞未经配子融合，经胚胎发育的典型阶段发育成完整植株的过程，可实现单个体细胞胚培养成一个完整植株。两项技术被广泛用于濒危、高附加值或难繁殖植物的规模化繁殖和新品种培育，如百山祖冷杉（Abies beshanzuensis）幼苗生产[14]、小报春（Primula forbesii）与岩生报春（P. saxatilis）新品种培育[15]、杨树（Populus L.）新品种培育[16]等。目前，茶（C. sinensis）[17]和油茶（C. oleifera）[18]均已构建体细胞胚胎发生体系，茶花中，金花茶（C. chrysanthe）[19]、长瓣短柱茶（C. grijsii）[20]、‘耐冬’[21]等均已从嫩茎、子叶等外植体构建再生体系，李纪元团队构建了长瓣短柱茶的体细胞胚胎发生体系，Vieitez等（1990）构建了红山茶的体细胞胚胎发生体系[22]。Lattier等（2008）开始对杜鹃红山茶的未成熟杂交胚进行胚拯救和体细胞胚胎发生诱导[12]。

为解决杜鹃红山茶在重庆自然气候条件下种子败育问题，本研究拟以川山茶和杜鹃红山茶为亲本，对未成熟杂交胚开展胚拯救，通过体细胞胚胎发生途径获得新种质无菌幼苗。最后，经炼苗移栽获得新种质幼苗。研究成果可突破杜鹃红山茶种子败育限制，为四季川山茶育种开辟新途径。

3／研究对象及方法

3.1 研究对象

（1）父本。于2023年2月25日至29日采集川山茶优良品种‘川牡丹’和‘怒春红’花粉，共计采集‘川牡丹’和‘怒春红’花粉各4管（2.0 mL）。

（2）母本。以中试基地内2021年和2022年栽植的36棵杜鹃红山茶植株为授粉母株。

3.2 研究内容及方法

3.2.1 中试基地气温监测

利用便携式自动气象站HOBO U30 Station每半小时自动记录一次试验地内的温度，探头高度1.5 m，以分析茶果坐果率等因素与温度的相关关系。

3.2.2 花粉采集

将采集的花苞按品种分别放置于不同采粉台，以避免花粉交叉，确保花粉品种纯正。花药在温度8-10 ℃且相对空气湿度在75%左右的自然环境中开裂后，及时用毛笔轻扫花药，采集花粉。于自然环境下静置24 h后，将花粉收集在2.0 mL的离心管中，密封后储存于-18℃的冰箱中，备用。

3.2.3 授粉

授粉从2023年5月20日持续至7月20日，为避免夏季高温对坐果率的影响，每日日出前后（上午6 点左右）开始，对36棵杜鹃红山茶进行逐株逐朵检查。因授粉期间，基地内的茶花中仅有杜鹃红山茶一种开花，所以授粉过程中未采取套袋措施。

3.2.4 茶果采收

在授粉结束后，每日日出前后逐株逐果检查茶果的数量、成熟情况。当发现果皮开裂、萎蔫或与花枝接触松动时，及时采收茶果和吊牌，并做好记录。

3.2.5 胚拯救

参照发明专利“利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法”（ ZL 202110676796.2）[23]和“一种利用未成熟杂交种子培育山茶花新品种幼苗的方法”（ ZL 202211076924.0）[24]的技术路线开展，采收的新鲜茶果需在采收当日完成外植体表面灭菌、进瓶。同时拍照，用Image J软件测量未成熟胚的长度和宽度。胚拯救及体细胞胚胎无性系构建流程如下：

（1）未成熟种子表面灭菌。

①流水冲洗。将种子分批次放置于玻璃瓶中，用表面扩张剂溶液浸泡20 min后，于自来水下冲洗1 h。

②消毒剂灭菌。在无菌条件下，将未成熟种子置于无菌三角瓶中，用75 %的乙醇溶液浸泡30 s，无菌水冲洗3-5次；然后用15 %的次氯酸钠溶液浸泡20 min，无菌水冲洗3-5次；灭菌完成后，剪破种皮，取出胚作为外植体。

（2）胚拯救培养。将外植体接种于胚拯救培养基中进行培养，胚拯救培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5-1.0 mg/L+NAA 0.05-0.5 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，PH值为5.8。

（3）胚性愈伤组织诱导。拯救成活的外植体接种于胚性愈伤组织诱导培养基中，诱导形成胚性愈伤组织，诱导培养基的组成为：MS培养基+BA 2.0 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，PH值为5.8。

（4）胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化。将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中，逐渐分化出处于不同发育阶段的体细胞胚胎，增殖培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，PH值为5.8。

（5）成熟和萌发。体细胞胚胎接种于萌发培养基中，培养形成具有茎段、顶芽和功能叶的炼苗材料，萌发培养基的组成为：1/2MS培养基+NAA 0.5 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，PH值为5.8。

（6）炼苗或生根。将生长健壮的植株接种于培养基质中，培养得到能够主动吸收营养的组培苗。培养基质为疏松多孔无菌基质，基质：水的质量体积比为1:2.5-3.0。

（7）移栽。将生长健壮的组培苗种植于草炭土和珍珠岩的混合基质中培养，得到山茶花新品种幼苗。

胚拯救过程中，无论无菌培养还是有菌培养，培养环境为：光照时间16 h/d，暗培养8 h/d，光照强度50 μmol/（m·s），温度25±2 ℃。

3.3 数据处理

采用Excel和SPSS19.0对试验数据进行汇总、分析。

4／结果与分析

4.1 试验地气温变化规律

基于便携式自动气象站HOBO U30 Station对2023年试验地内气温数据记录发现，杂交授粉从5月20日开始至7月20日结束，期间月平均气温在23.1 -28.0 ℃之间，其中5月和6月的月平均气温变化相对较小，维持在23.1 -24.4 ℃。

授粉试验期间，日平均气温、最高气温、最低气温随时间表现出逐渐增高的趋势，昼夜温差受自然降雨的影响较大，与时间变化的相关性不大。其中，日平均气温在19.1-34.2 ℃之间变化，6月25日之后，日平均气温达到30 ℃以上，日最高气温在达到35 ℃以上。

4.2 品种对坐果的影响

茶果采收期从7月23日至9月8日。2023年以川山茶优良品种‘川牡丹’和‘怒春红’为父本，以杜鹃红山茶为母本，开展杂交育种，两个川山茶品种授粉及坐果情况见表1。

其中，‘川牡丹’作为主要育种父本，共计授粉2777朵花，获得茶果339个，种子844颗，其中未成熟胚498个，空壳种子346颗，3个花粉编号所得种子的空壳率维持在38.17-42.42%。以2号和3号花粉的授粉数量较少（377朵和757朵），但坐果率最高，分别达到27.85 %和18.23 %；6号花粉授粉花朵数量最多（1643朵），但坐果率最低（5.84%）。3个编号的花粉主要采集于2月25日-27日，来源于同一批花朵，由于花药开裂时间不同而导致采集时间不同，形成不同的编号。坐果率的差异可能与授粉时间相关，2号和3号花粉的授粉时间为5月20日-6月18日，此时气温变化相对较小，柱头败育花朵出现的比例较小，6号花粉的授粉时间为6月14日-7月20日，随着气温的升高，柱头败育花朵大量出现，占总花朵数量的58.1%。加之，母株体内营养的逐渐损耗和气温升高，从而导致坐果率逐渐降低[25]。

以‘怒春红’作为父本，共计授粉850朵花，获得茶果45个，种子98颗，其中未成熟胚71个，空壳种子27颗，2个花粉编号所得种子的空壳率维持在27.16 %-29.41 %。7号和9号花粉分别采集于2月27日和29日，其坐果率分别2.93%和7.86%，坐果率的差异与‘川牡丹’一样，可能与授粉时间相关。

相对而言，‘怒春红’的坐果率和种子空壳率均低于‘川牡丹’，这可能与品种不同有关。

4.3 茶果和种子采收数量随时间变化规律

统计每日采收的茶果、种子和空壳种子数量，结果如图1。可见，茶果、种子和空壳种子数量随时间推移呈先增后降的趋势。其中以8月19日至26日出现茶果采收的最高峰，日平均采收茶果21个；又以8月19日和20日采收的茶果数量较多且获得的未成熟胚数量最多（46颗和41颗）。

对384个茶果的成熟时间进行正态分析发现，茶果成熟时间符合正态分布，其公式为N（69.45，52.59），极大值和极小值分别为42 d和89 d，95 %的置信区间为（64.2，74.7），即茶果的成熟时间主要集中在授粉后64 d-75 d之间。

图1 种子和茶果采收数量随时间变化规律

总体而言，茶果和种子的得率为1:2.45，茶果和未成熟胚的得率为1:1.48，茶果和空壳种子的得率为1:0.97，即一个茶果中孕育了2.5颗种子，其中有1颗空壳种子和1.5个未成熟胚。该结果与柯欢等在2010-2012年的试验结果相似[26]，当以杜鹃红山茶为母本，10个红山茶原种为父本进行组内杂交时，每果结种数从0.67颗-3.40颗不等，而杜鹃叶山茶自然杂交的每果结种子数约为2.88 颗[27]。

4.4 种子重量、未成熟胚大小随采收时间变化规律

利用将每日采收的种子平均重量、未成熟胚的平均长度和宽度与采收日期进行分析（见图2和图3）。

结果发现，随着采收时间的推移，种子平均重量、未成熟胚的平均长度和宽度均呈递减的趋势，尤其是8月10日之后采集的种子，其平均重量急剧下降，未成熟胚的平均长度和宽度亦如此。7月23日至8月10日种子的平均重量基本维持在0.090 g-0.179 g之间，未成熟胚的平均长度和宽度在1.7 mm-11.4 mm之间；8月10日之后，平均重量维持在0.019 g-0.082 g之间，未成熟胚的平均长度和宽度在1.3 mm-4.8 mm之间。虽然8月19日-20日茶果和种子的采收数量达到最多，但是平均重量仅为0.051 g-0.064 g，未成熟胚的平均长度和宽度为2.5 mm-3.8 mm。

结合试验发现，2023年收获的最大种子为8月8日采收于8号母株，其父本为‘川牡丹’，重量为0.933 g，其未成熟胚的平均长度和宽度为11.3 mm和9.8 mm。

4.5 体细胞胚胎无性系构建

4.5.1 胚拯救培养

942颗杂交种子经表面灭菌处理后，在无菌条件下剥开种子，取出未成熟胚，共计569个，将其接种于胚拯救培养基中培养，如图4A、4B和4C。不同茶果中种子的数量差异较大，1-6颗不等。如茶果L297中孕育了6颗种子，重量从0.005-0.417 g不等。在无菌条件下播出6个未成熟胚，未成熟胚的长度和宽度最大值和最小值为0.9-11.3 mm。诱导出4个体细胞胚胎无性系，这是所有茶果中得率最高的。种子之间的重量和未成熟胚的大小差异较大，种子重量从0.001-0.933 g，未成熟胚的长度0.3-13.7 mm，宽度0.2-13.0 mm。较小的未成熟胚成圆形，白色略显透明，未见器官分化。

在胚拯救培养基中培养3个月后，统计并分析胚拯救成活新种质的未成熟胚长度、宽度和种子重量之间的相关关系，发现未成熟胚长度、宽度和种子重量之间呈极显著相关，即未成熟胚长度和宽度越大，种子重量越重。但是胚拯救成活的培养时间与种子本身并未达到显著相关，即当种子本身达到一定的大小后，其胚拯救成活的培养时间仍旧集中在36 d-41 d，并不是未成熟胚越大、种子越重，诱导时间越短。

A杂交授粉获得的L297茶果。B L297茶果中的6颗未成熟种子。C从种子中剥离的未成熟胚，子叶透明。D胚性愈伤增殖及处于不同发育阶段的次生胚。E子叶形胚萌发成苗。F炼苗移栽成活的幼苗。

4.5.2 胚性愈伤组织诱导

未成熟胚接种于胚拯救培养基后，子叶膨大，呈嫩黄色，进而分化出胚性愈伤，胚芽、胚轴和胚根则进一步发育形成完成幼苗或者在胚根处形成胚性愈伤组织。如图4C，透亮的子叶发育相对较晚，营养累积不够，但胚根处逐渐变绿，继代至胚性愈伤组织诱导培养基中，胚根处继续膨大并诱导出胚性愈伤组织。在茶果L297中，长度和宽度为2.3-3.2 mm的未成熟胚可以诱导出细胞胚胎。

4.5.3 胚性愈伤组织增殖及体细胞胚胎分化

将胚性愈伤组织接种于增殖培养基中，分化出大量的次生胚，在较大的次生胚上生长着大量处于不同发育阶段的次生胚（图4D）。因此在同一培养瓶内可以看到球形胚、鱼类型胚和子叶形胚。

4.5.4 成熟和萌发

将发育较好的子叶形胚接种于成熟和萌发培养基中，3个月后，萌发成苗，多次继代培养后，待幼苗长至基部粗约1 mm，高度5 cm，且须根发达时，进行炼苗移栽（图4E和4F）。

4.6 胚拯救成活新种质的种子特性研究

基于现有胚拯救技术体系，对获得的569个未成熟胚开展胚拯救，共计获得114个胚拯救成活的新种质，其颜色逐渐变为绿色。对拯救成活的未成熟胚开展胚性愈伤组织诱导，获得99个体细胞无性系，剩余15个成活新种质由于种子过小，生长缓慢，仍处于体细胞胚胎诱导阶段。对114个胚拯救成活新种质的种子重量、未成熟胚的长度和宽度进行正态分布分析，发现三者均呈正态分布，公式分别为N（0.189，0.021）、N（6.5，8.671）和N（5.5，7.380）。根据95%置信区间，胚拯救成活的种子重量为0.050-0.091 g，未成熟胚的长度为6.0 mm -7.1 mm和宽度为2.6-2.9 mm。

试验发现，942颗种子中，仅有10.62 %的种子重量大于0.100 g，却有56.5%的种子重量小于0.030 g。569颗未成熟胚中，仅有16.1 %的未成熟胚长度大于5.97 mm。

5／结论与讨论

为了延长重庆地区茶花的花期，2007年重庆市林业科学研究院引种了杜鹃红山茶[28]，花期从每年4月下旬至12月，但其种子在自然条件下很难播种成苗，这极大地限制了四季茶花的育种。虽然高继银老师培育的四季茶花品种具有多季开花的特性，但在引种至重庆地区后，仅前两年表现出夏季开花特性，之后花期主要集中在10月至12月之间。相对而言，川山茶的花期则集中在11月至翌年3月，四季茶花的引种并未有效延长重庆地区茶花的观赏期，花期仅提前月余。因此，以川山茶优良品种为父本，以杜鹃红山茶为母本，开展杂交育种，有望构建川山茶的夏季开花品种群。

2023年的授粉工作从5月20日开始至7月20日结束，共计完成3627朵花；茶果采收从7月23日开始至9月8日结束，共计获得茶果384个，种子942颗，从中播出未成熟胚569个。942颗种子中，有89.38%的种子重量不足0.100 g，0.030 g以下种子占种子总量的56.30 %，大小仅有0.3-5.3 mm，种子最重不超过1 g。这与Lattier等（2008）的研究结果相似，杜鹃红山茶的种子很难自然发育成熟[12]。因此，通过胚拯救和体细胞胚胎发生途径获得四季川山茶新材料成为解决杜鹃红山茶种子败育的新希望。

传统育种中，山茶主要通过播种育苗的方式获得育种新材料，种子能否萌发与其成熟程度密切相关，这是自然选择的结果。Lattier等（2008）对杜鹃红山茶不能萌发的未成熟胚开展胚拯救及育苗研究，以提高新种质的产量[12]。胚拯救常用于未成熟胚，胚发育不成熟主要体现无法播种萌发成苗，主要原因包括有营养、生理或遗传等单个或多个问题，或发育早期阶段就败育或退化[29]。杜鹃红山茶的杂交胚常处于圆球形胚或鱼雷形胚阶段，其子叶营养累积不够且胚芽、胚轴和胚根发育不完全。前者，因此杜鹃红山茶的胚拯救侧重于选择合适的培养基，提供充足的营养物质和植物生长调节剂，促使胚发育完全。

山茶的成熟种子包括种皮和胚两部分，无胚乳。种皮由珠被发育而来，胚由受精卵发育而来，经原胚期、球形胚、鱼雷形胚、子叶形胚等发育阶段，形成子叶、胚芽、胚轴和胚根，胚乳的营养被胚吸收，从而消失[30]。子叶与其他部分器官均由受精卵发育而来，因此山茶的胚性愈伤诱导中，无论是胚芽、胚轴和胚根直接诱导体细胞胚胎，还是从子叶间接诱导体细胞胚胎，胚性愈伤所含的遗传物质一致。山茶胚拯救即将圆球形胚、鱼雷形胚、子叶形胚等发育阶段的胚置于人工培养基中，促使其完成发育并萌发成苗。同时从未成熟胚诱导产生体细胞胚胎，构建体细胞胚胎无性系，大量培育遗传信息一致的杂交后代[12]。因此，杜鹃红山茶胚拯救的主要对象为未成熟胚。

研究发现，未成熟胚拯救成活率为20.04 %，体细胞胚胎无性系诱导率为86.84 %。然而，7月23日至8月10日获得的未成熟胚质量较好，其胚拯救成功率为35.71%，可见，未成熟胚的营养累积程度与胚拯救成功率密切相关。0.030 g以下种子占种子总量的56.30 %，大小仅有0.3-5.3 mm。因此下一步将从加强授粉母株的施肥养护和优化极小未成熟胚的胚拯救配方两个方向，进一步提升创新种质的培育效率。

胚拯救和体细胞胚胎发生是传统育种方法的有效辅助手段，在获得远缘杂种、阻止胚早期败育、提高植株再生率及缩短育种周期等方面具有重要作用[31,32]。虽然该方法仍旧基于遗传物质的自由组合，属于非定向育种，但是由此构建的体细胞胚胎无性系为体细胞杂交和转基因育种提供了基础。

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